Энтомопатогенные бактерии принадлежат к различным таксономическим группам эубактерий. Среди факультативных патогенов различают такие виды, как Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Streptococcus faecalis, Bacillus cereus, а среди облигатных энтомопатогенов — виды Streptococcus pluton (возбудитель европейского гнильца пчел), Bacillus larvae (возбудитель злокачественного, или американского гнильца пчел), Bacillus popilliae (возбудитель молочной болезни личинок жуков). Особое место занимают токсигенные бактерии, например, Bacillus thuringiensis (возбудитель «паралича» гусениц).
«Schlafsucht» (нем.) — дословно летаргия, сонливость; в советской литературе принято выражение «паралич».
Для микробиологической борьбы с вредителями в первую очередь пригодны спорообразующие виды Bacillus, так как их покоящиеся споры, или эндоспоры, устойчивы к воздействию давления (что важно при механизированном внесении) и к высушиванию (на обработанном объекте).
В. popilliae была выделена в США в 1939 г. из личинок японского жука Popilliae japonica, пораженных так называемой молочной болезнью. Вредитель, завезенный из Восточной Азии, активно размножался из-за отсутствия естественных врагов. Его личинки наносили огромный ущерб газонам, а имаго повреждали древесину плодовых деревьев и других представителей розоцветных.
Так как другие средства борьбы оказывали лишь кратковременное воздействие, с 1940 по 1960 г. на газоны общей площадью более 80 000 га было внесено свыше 100 т дуста, содержавшего споры В. popilliae. Препарат титром 108 спор/г в дозе 2 кг/га обеспечил 90%-ную гибель вредителя.
Ни на одной из до сих пор испытанных сред возбудитель не продуцирует вирулентных спор, поэтому его необходимо размножать только в организме хозяина. С этой целью В. popilliae вводят в организм личинки путем инъекции. Выход патогена составляет около 109 спор на личинку. Погибших от бактериоза личинок измельчают, и полученный сырой препарат смешивают с наполнителем. Дусты на этой основе под названием дум («Doom») находятся в продаже в США. Их активность сохраняется в течение многих лет. Обработку этими препаратами осуществляют в основном путем введения в почву, зараженную личинками жука. Наполненные спорами трупы погибших от бактериоза личинок разлагаются, и почва постепенно становится подлинным резерватором спор. Кроме того, бациллы медленно, но непрерывно распространяются в популяциях личинок, заселяющих обработанный район. Таким путем в восточных штатах США японский жук постепенно утратил свое значение на больших пространствах.
К сожалению, в некоторых районах эффективность В. popilliae заметно снизилась. По данным лабораторных исследований, причина этого заключается не только в развитии устойчивости насекомых при длительном контакте с возбудителем, но и в снижении вирулентности патогена в результате большого числа пассажей через хозяина.
Эффективность В. popilliae ограничена только личинками Scarabeidae, причем для каждого штамма характерен определенный круг хозяев.
В настоящее время, кроме Bacillus popilliae и выделенной также из личинок японского жука Bacillus lentimorbus, известен еще целый ряд облигатных патогенных видов Bacillus, вызывающих молочную болезнь личинок Scarabeidae.
Например, вышеуказанная В. popilliae, выделенная из японского жука, практически авирулентна для личинок майского хруща. В то же время в 1955 г. во Франции Харпин обнаружил разновидность melolonthae, эффективную против майского хруща, распространенного в Европе. Споровые препараты на основе этой разновидности испытывали в течение семи лет, сравнивая их с другими патогенами на пастбищах Северной Франции. Оказалось, что var. melolonthae уступает по эффективности грибному препарату на основе Beauveria tenella, но обладает более высокой лежкостью.
Bacillus thuringiensis была впервые выделена Берлинером в 1911 г. в Германии из больных гусениц мельничной огневки Ephestia kiihniella. Бациллу можно свободно культивировать на искусственных средах. Цикл развития этого микроорганизма представлен на рисунке 10. Образование покоящихся спор и параспоральных кристаллов происходит только при аэрации.
В настоящее время идентифицировано около 700 изолятов В. thuringiensis. Они относятся к нескольким разновидностям, которые на основе наличия жгутиков были сгруппированы в 20 Н-серотипов. Разновидности, не несущие жгутиков, например var. wuhanensis, нельзя типизировать по этому признаку.
Инсектицидная активность спорулирующих культур В. thuringiensis ограничена определенными группами хозяев. Так, штаммы серотипов Н-1 — Н-13 и var. wuhanensis поражают в основном гусениц чешуекрылых. Первичное действие патогена обусловлено токсичностью параспоральных кристаллов (=эндотоксина). После заглатывания содержащего кристалл спорового препарата токсин кристалла растворяется в щелочной среде кишечника восприимчивой гусеницы и вызывает паралич кишечника путем разрушения его эпителия. Клетки бактерий из спор проникают в полость тела и вызывают сепсис. При умеренных температурах (15—25 °С) гибель восприимчивых гусениц происходит в течение пяти дней. Внесение достаточно высоких доз препарата уже в течение первых суток сопровождается прекращением питания гусениц, т. е., несмотря на несколько замедленную гибель, они наносят значительно меньший ущерб. Однако при применении В. thuringiensis против вредных чешуекрылых патоген не способен вызывать эпизоотию или распространяться в биотопе вредителя, даже если он находится в нем достаточно длительное время.
Первые полевые испытания В. thuringiensis проведены в 1928—1931 гг. в Венгрии и Югославии, но цель борьбы — уничтожение стеблевого мотылька Ostrinia nubilalis — была достигнута в этих опытах только частично. Против этого же вредителя были направлены в 30-х годах опыты Экштейна в Германии и Поспелова в СССР, но и они не дали удовлетворительных результатов. Однако уже в 1936 г. Поспелов добился успеха в небольшом опыте с гусеницами капустной белянки Pieris brassicae и, наконец, в 1951 г. Клемент в Венгрии и Штейнхаус в Калифорнии получили максимальный эффект при использовании В. thuringiensis соответственно против американской белой бабочки Hyphantria cunea и люцерновой желтушки Colias eurytheme. После того как в 50-е годы с помощью В. thuringensis была проведена успешная борьба против гусениц белянок и других вредителей в ФРГ, Франции и СССР, производством соответствующих биопрепаратов заинтересовалась промышленность.
В настоящее время промышленные препараты на основе Bacillus thuringiensis находятся в продаже. Это, например, турицид HP и дипел американского производства; в Европе, кроме выпускаемого во Франции препарата бактоспеина, вышеуказанные препараты также поступают в продажу. СССР выпускает два бактериальных препарата — энтобактерин и дендробадиллин.
Современные производственные штаммы этой группы препаратов относятся к следующим серотипам: Н-1 — бактоспеин; Н-3 а и в — дипел, турицид HP; Н-4 а и в — дендробадиллин; Н-5 а и в — энтеробактерин.
Ежегодный объем мирового производства инсектицидов на основе В. thuringiensis уже превысил 1000 т. Так, в США за 1968 г. оно составило около 200 т, в Китае (отчасти на мелких предприятиях в коммунах) в 1977 г. — около 250 т. В 1976 г. в США было обработано около 600 тыс. га площадей, в Китае в 1977 г. — около 200 тыс. и в Европе — около 40 тыс. га. Ежегодное потребление бактериальных препаратов в ФРГ составляет около 2 т на 1000—2000 га, а в США и Канаде совместно — более 1000 т почти на 1 млн. га.
Производственный штамм — В. thuringiensis var. wuhanensis.
Для использования в полевых условиях смачивающиеся порошки большинства препаратов суспендируют в воде и вносят с помощью обычных наземных машин или опрыскиванием с воздуха. При титре 2,5·1010 спор и кристаллов/г рекомендуется расходовать от 300 до 2000 г смачивающегося порошка на 1 га, т. е. соответственно 7,5·1012 — 5·1013 спор и кристаллов/га.
В. thuringiensis эффективна в борьбе с гусеницами примерно 250 видов чешуекрылых, причем против более 75 видов дает результаты от удовлетворительных до хороших. Если для 50%-ной гибели восприимчивых видов, например белянок, достаточно дозы 5·104 спор и кристаллов в расчете на гусеницу среднего возраста, то для менее восприимчивых видов, например капустной металловидки, соответствующий результат дает применение более 1,5·106 спор и кристаллов на гусеницу. Несмотря на то, что В. thuringiensis патогенна только для личиночных стадий насекомых, чешуекрылые могут погибать в стадиях предкуколки и куколки при условии, что данной дозы было недостаточно для немедленной гибели гусениц. Реакцией на сублетальные дозы В. thuringiensis часто является снижение плодовитости и фертильности, причем даже у тех видов насекомых, которые отличаются пониженной восприимчивостью к патогену.
Как кишечный яд В. thuringiensis малорезультативна не только против слабовосприимчивых видов (совки и некоторые шелкопряды), но и против тех вредителей, гусеницы которых сами по себе восприимчивы, однако питаются недостаточно долго и уходят в субстрат. К вредителям такого типа относятся зерновые моли, листовертки (яблонная плодожорка и сетчатая листовертка) и огневки (стеблевой мотылек; см. также ниже).
Препараты В. thuringiensis оказались пригодными для борьбы со многими важными видами чешуекрылых вредителей леса. В странах Европы и в СССР была осуществлена успешная борьба с сибирским шелкопрядом Dendrolimus sibiricus, зеленой дубовой листоверткой Tortrix viridana, сосновым походным шелкопрядом Thaumeiopoea pityocampa и Zeiraphera diniana. На значительных площадях проводили авиаобработки, причем в Средней Европе — преимущественно с вертолета, а на лесных массивах Сибири и Северной Америки — с помощью самолета. При расходе рабочей жидкости от 50 до 100 л/га концентрации препаратов составляют 1—4%. О новых успехах по применению В. thuringiensis в Северной Америке против вредителей леса (Lymantria dispar, Choristoneura fumiferana, Orgyia pseudotsugaia, Malacosoma sp.) сообщил Харпер.
В сельском хозяйстве, особенно в Европе, доминируют наземные обработки (за исключением больших площадей, занятых монокультурами). В этом случае расход рабочей жидкости может быть значительно больше, например при обработке овощных культур — до 500—1000 л/га, а концентрация ее снижается до 0,2—0,4% при использовании промышленных препаратов с титром 2,5·1010 спор и кристаллов/г смачивающегося порошка. До настоящего времени В. thuringiensis успешно применяли для уничтожения многих видов чешуекрылых, являющихся важными сельскохозяйственными вредителями. В странах Европы и в СССР особенно результативной была борьба с белянками (виды Pieris) и капустной молью Plutella maculipennis на капусте, а также с плодовой молью (виды Hyponomeuta), боярышницей Aporia craiaegi, златогузкой Euproctis chrysorrhoea, кольчатым шелкопрядом Malacosoma neustria и американской белой бабочкой Hyphantria cunea в плодовых насаждениях.
Зависимость эффективности В. thuringiensis от кормового растения доказана на примере кистехвоста обыкновенного Orgyia antiqua: при одних и тех же дозах гусеницы, питавшиеся на боярышнике, были поражены В. thuringiensis очень незначительно, на ели и малине они оказались более восприимчивыми, а на груше поражаемость была максимальной.
После ряда неудач, постигших исследователей в 30-е годы, в настоящее время не только в США, но и в Европе В. thuringiensis вновь начали применять против стеблевого мотылька (во Франции — с 1968 г., в ФРГ — с 1970 г.). Современные бактериальные препараты не уступают по эффективности большинству обычных химических инсектицидов: двукратное опрыскивание дозой 2 кг/га на 500 л воды обеспечивает гибель не менее 70% вредителей. В 1977 г. в Баден-Вюртемберге (ФРГ) успешно проведена авиаобработка 700 га посевов кукурузы при общем расходе 2,8 т смачивающегося порошка В. thuringiensis.
Одна из возможностей применения В. thuringiensis в борьбе с относительно невосприимчивыми видами заключается в разбрасывании приманок, позволяющем вносить более высокие дозы патогена. Например, при посеве салата в парниках через 3—4 дня после внесения приманок, содержавших 2% препарата В. thuringiensis, гибель находившихся в почве гусениц озимой совки Agrostis segetum достигала 87—97%; выжившие особи значительно отставали в развитии.
Следует также отметить значение бактериальных препаратов в борьбе с вредителями запасов (амбарная огневка, зерновая и большая восковая моли). Еще в 1915 г. Берлинер предложил использовать В. thuringiensis против амбарной огневки. Однако лишь недавно Шмидт и Вольгемут доказали результативность турицида HP в борьбе с южной амбарной огневкой Plodia interpunctella в зернохранилище. Хранившаяся насыпью рожь была покрыта слоем зерна глубиной 10 см, содержавшего 109 спор и кристаллов на 100 г зерна; гибель Р. interpunctella при такой поверхностной обработке составила 97—100%. В США В. thuringiensis (препарат дипел) применяют для борьбы с мельничной (Cadra cautella) и южной амбарной огневками в хранилищах не только пшеницы и кукурузы, но и сои и подсолнечника. Кроме того, в США разработан новый препарат на основе В. thuringiensis (серотип Н-7) под названием цертан, предназначенный для уничтожения большой восковой моли Galleria mellonella в пчелиных сотах и совершенно безвредный для медоносной пчелы.
В связи с массовым применением препаратов на основе В. thuringiensis, прежде всего в сельском и лесном хозяйстве, встает вопрос о возможном развитии у насекомых устойчивости к патогену. По данным экспериментов, под давлением отбора, вызывавшем 90- или 60%-ную гибель насекомых за 10 или 30 поколений соответственно, никакого достоверного усиления устойчивости в популяциях хозяина (Plutella maculipennis) не отмечено. Напротив, в результате долговременного контакта с патогеном в отселектированной популяции насекомого-хозяина было обнаружено выраженное ослабление жизнеспособности и плодовитости, т. е. последействие патогена.
Установлено, что споры В. thuringiensis восприимчивы к УФ-лучам и выдерживают прямой солнечный свет не более часа, в противоположность стабильным кристаллам токсина. Поскольку для воздействия на гусениц многих чешуекрылых необходимы не только кристаллы токсина, но и споры, инактивация последних на обработанной поверхности УФ-лучами отрицательно отражается на эффективности обработки. В этом случае целесообразно использовать добавки, защищающие препараты от облучения. Однако в целом для борьбы с гусеницами достаточно лишь токсина, поэтому жизнеспособные споры можно инактивировать гамма-, ультрафиолетовым и рентгеновским облучением, не снижая эффективности биопрепарата. Подобные препараты В. thuringiensis с редуцированным числом спор были использованы в ФРГ для борьбы с личинками комаров,
В последнее время в рамках программы Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по биологической борьбе с важными переносчиками болезней человека и животных также ведутся поиски способов применения для этой цели энтомопатогенных бактерий.
Изучая виды Bacillus кулицидного действия, Зингер в США выделил наряду со штаммами группы В. alvei-circulans также штаммы В. sphaericus, быстро убивающие личинок Culex fatigans. У одних штаммов В. sphaericus (например, у изолята № 1321 из Индии) токсин кулицидного действия как эндотоксин содержится в вегетативных клетках, в то время как у других (например, у изолята № 1593 из Индонезии) — в спорах. Активность штаммов В. sphaericus распространяется на личинок родов Culex и Psorophora. В испытаниях, проведенных в Калифорнии, изолят 1593 дал хорошие результаты (до 90% гибели) в борьбе с Culex tarsalis при концентрации 104 спор/мл, но оказался неэффективным против видов Aedes, присутствовавших в опыте, и видов Simulium. По-видимому, после введения в биотоп комара В. sphaericus приобретает устойчивость, хотя его активность против личинок комара снижается под воздействием УФ-лучей (в отличие от В. t. var. israelensis).
Эффективные против комаров штаммы непатогенны для человека, полезных животных и рыб, а также для нецелевых водных членистоногих, например некоторых полужесткокрылых, стрекоз и жуков-водолюбов.
В 1977 г. на Ближнем Востоке была выделена новая разновидность В. thuringiensis — var. israelensis (серотип Н-14), которая в отличие от других известных разновидностей (или серотипов) действовала губительно только на личинок двукрылых. Она эффективна против пяти видов комаров, относящихся к четырем родам, в том числе Aedes aegypti, Anopheles sergentii, Culex pipiens. Постепенно восприимчивость к этой разновидности была обнаружена у личинок около 30 видов комаров из шести родов и у личинок видов Simulium. Большое преимущество новой разновидности В. thuringiensis заключается также в ее групповой специфичности, которая ограничивается личинками двукрылых (Nematocera). В 1980 г. в заповеднике кантона Валли (Швейцария) провели первые полевые испытания В. t. var. israelensis. Через 36 ч в различных прудах, обработанных препаратом с титром 1,4…7·104 спор и кристаллов/мл, популяции, состоявшие из личинок Aedes vexans, А. саtaphylla и A. communis полностью погибли. Никакого побочного действия на водную фауну обнаружено не было, причем особое внимание уделяли развитию Ostracoda, Odonaia, Plecoptera, Dytiscidae.
Лабораторные и полевые опыты по борьбе с личинками комаров были проведены и в ФРГ (район Верхнего Рейна). Препараты на основе var. israelensis содержали пониженное число жизнеспособных спор в результате инактивации облучением для максимального сокращения споровой нагрузки на водоемы. При концентрации 104…105 кристаллов/мл была достигнута 100%-ная гибель насекомых, в том числе личинок старшего возраста Aedes cantans, A. rusticans и Culiseta morsitans даже при температуре воды в пределах 5,5…8,5 °С. В настоящее время на Средиземноморском побережье Южной Франции осуществляется проект биологической борьбы с комарами путем использования препаратов на основе этого патогена. По данным опытов, температура и концентрация солей мало влияют на эффективность обработок против Anopheles airopalpus, Aedes aegypti, A. caspicus, A. detritus и Culex pipiens, хотя сравнительные испытания показали значительные колебания в восприимчивости популяций комаров к var. israelensis. В соответствии с проектом ВОЗ, в Западной Африке (Берег Слоновой Кости) в опытных испытаниях доказана также возможность применения этого патогена для борьбы с личинками Simulium damnosum — переносчика опасной болезни онхоцеркоза.
В США (Калифорния) хорошие результаты дала обработка водоемов, зараженных личинками Aedes spp. и Culex tarsalis, жидким препаратом В. t. var. israelensis, причем оказалось, что загрязненные воды требуют более высоких доз при борьбе с комарами, чем чистые (как и в случае с В. sphaericus).
В полевых условиях активность В. t. var. israelensis сохраняется обычно лишь несколько дней, хотя Ларге в лабораторных опытах смог показать, что при внесении препаратов с активными спорами в погибших личинках могут выживать жизнеспособные бактерии, в. дальнейшем это приведет к возрастанию их активности. По-видимому, таким образом обеспечивается определенная стойкость В. t. var. israelensis (как и В. sphaericus) во внешней среде.
Поскольку В. t. var. israelensis безвредна почти для всех водных членистоногих (включая хищных личинок комаров Chaoborus и Mochlonix), хищники в обработанных водоемах могут способствовать дальнейшему сокращению численности популяций комаров.
Исключением являются личинки хирономид.
К естественным врагам личинок, против которых var. israelensis неэффективна, относятся также некоторые водные позвоночные, например рыбы (особенно виды Gambusia), саламандры и подкаменщики. Создание соответствующей системы интегрированной борьбы с кровососущими комарами путем использования надежных в гигиеническом и экологическом отношении препаратов В. thuringiensis позволило бы найти приемлемое решение проблемы, связанной с переносчиками заболеваний.