Микробиологическая борьба с вредителями — это использование микроорганизмов (в том числе вирусов) для регулирования, снижения численности или полного уничтожения популяций вредителей. Одним из путей в данном случае является применение микроорганизмов как природных антагонистов вредных микроорганизмов.
Другой путь заключается в использовании менее вредоносных штаммов микроорганизмов для борьбы с возбудителями болезней (так называемыми патогенами), т. е. для их подавления или вытеснения.
Инфекционные болезни, патология и эпидемиология
В пределах пищевой цепи гетеротрофные организмы живут за счет органического субстрата (сапрофиты, сапрофаги) или же за счет других организмов, являясь при этом хищниками (фитофаги, зоофаги и др.) или паразитами. Особую форму паразитизма представляет инфекция, характеризующаяся прониканием микроорганизмов или вирусов в организм или клетки хозяина.
Под инфекционным заболеванием понимают непосредственное поражение организма хозяина патогенными микроорганизмами или вирусами. С этой точки зрения каждое инфекционное заболевание представляет собой не что иное как особую форму антагонизма между живыми организмами — возбудителем заболевания (патогеном) и хозяином.
Заражение, однако, не обязательно должно сказываться отрицательно на развитии хозяина, оно может быть для него практически безразличным, а иногда даже необходимым, если хозяин использует микроорганизм для питания. Если в процессе эволюции развилась тесная зависимость хозяина от определенных метаболитов микроорганизма, то для сохранения жизнеспособности хозяин вынужден выносить присутствие такого постоянного «гостя». Одна из форм сосуществования между хозяином и гостем (=симбионтом) получила название симбиоза.
Симбиотические микроорганизмы часто составляют важнейшую часть микрофлоры кишечника животных, синтезируя для хозяина дополнительные вещества, не содержащиеся в продуктах питания. Еще один пример — симбионты в ризосфере растений, обеспечивающие их питание. Проникание чужеродных микроорганизмов-антагонистов как в микрофлору кишечника, так и в ризосферу может привести к серьезным нарушениям или патологическим изменениям в организме.
Многие возбудители болезней проникают в живые клетки и только в них способны размножаться. К таким облигатным клеточным паразитам относятся вирусы, риккетсии и микроспоридии, а также некоторые бактерии и грибы. Однако многие патогенные бактерии и грибы являются токсигенными сапрофитами, которые размножаются вне клеток хозяина и вызывают его повреждения или гибель, выделяя ингибиторы или ядовитые вещества (антибиотики или токсины).
В то время как патология инфекционных заболеваний занимается взаимодействием хозяина как отдельной особи и возбудителей болезней (пути заражения, защитные реакции, течение болезни, механизмы действия), эпидемиология рассматривает возникновение, распространение и затухание массовых заболеваний (эпидемий) в популяциях хозяина.
Решающими для распространения возбудителей болезней в пространстве и во времени являются способы передачи инфекции. Различают горизонтальную передачу инфекции между особями одного поколения и вертикальную — от родителей потомству (в большинстве случаев через яйцо, но не всегда). Горизонтальная передача осуществляется при заражении, т. е. прямом контакте с инфицированным хозяином, или косвенным путем, при поглощении возбудителей, длительное время обитающих в биотопе. В процессе распространения инфекции могут также принимать участие живые организмы, так называемые переносчики, или векторы. Так, переносчиками многих вирозов растений служат определенные сосущие фитофаги (тли, цикады), а многочисленных вирусных болезней человека и позвоночных — различные кровососущие насекомые (комары, клещи и др.). Если исключить такого переносчика, инфекционная цепочка нарушается, поэтому уничтожение векторов (борьба с переносчиками) имеет решающее значение в подавлении инфекционных болезней, которые распространяются насекомыми. И наоборот, при недостатке определенных переносчиков в биотопе микробиологическая борьба с вредными организмами может потерпеть неудачу. Примером служит неудача с акклиматизацией вируса миксоматоза кроликов в Новой Зеландии. Иногда возбудитель может пассивно переноситься живым организмом, попадая в него с пищей и выживая в кишечнике этого «переносчика»; с фекалиями и выводится наружу. Таким образом способствуют распространению энтомопатогенных вирусов некоторые насекомоядные птицы и хищные насекомые.
Экология инфекционных болезней показывает, что возбудитель только тогда регулирует динамику численности популяций, когда проявление болезни зависит от плотности популяции. Такие инфекции называют заразными болезнями, или эпидемиями.
Вспышки таких болезней среди хозяев-животных часто называют эпизоотиями, среди растений — эпифитотиями.
Они характеризуются острыми поражениями с выходом возбудителя и его горизонтальным переносом. Только при таких условиях степень распространения возбудителя может возрастать с увеличением плотности популяции.
Что же касается причины вспышки эпидемии на пике массового размножения хозяина, то можно себе представить следующее: при постоянном увеличении плотности популяция в конечном счете достигает такого уровня, что ее особи заражаются даже «следами» сохраняющегося в природных условиях патогена. Вследствие этого вспыхивает эпидемическая цепная реакция, при которой от так называемого эпицентра вспышки волны эпидемии распространятся к периферии. Наблюдения за эпизоотиями вирозов насекомых в лесных насаждениях подтвердили этот часто регистрируемый при распространении болезней растений процесс. Причину такого развития в пространстве и во времени следует искать в поведении возбудителя, который распространяется в восприимчивой популяции и в зависимости от степени поражения делает ее более или менее выносливой, но менее многочисленной. В результате последующего снижения плотности возбудителя может вновь сформироваться восприимчивая популяция хозяина. Именно такой характер носят периодические вспышки распространения лесных насекомых-вредителей, которые каждый раз погибают от вирусных эпизоотий, и это же относится к периодичности эпизоотии бешенства и непосредственно связанной с ней динамике популяций лис.
Противоположность эпидемиям представляют собой эндемии — не зависящие от плотности популяции инфекции.
Называемые также энзоотиями при возникновении у животных или энфитотиями — у растений.
При таких преимущественно хронических инфекциях перенос возбудителя идет в основном вертикально, как, например, генетические факторы. Примерами этому служат многие болезни, вызываемые вирусами, риккетсиями или микроспоридиями. Такие инфекции, не зависящие от плотности популяции, не обеспечивают постоянное регулирование численности насекомых, но могут снижать фактическую их плотность и поэтому сдерживать периодические колебания популяции. Если при искусственном инфицировании возбудители болезней не вызывают эпидемии или эндемии, так как их перенос идет недостаточно активно, то тем не менее они могут обусловить не зависящую от плотности инфекцию, при которой возбудители действуют как токсические факторы. Примером в данном случае служит применение Bacillus thuringiensis.
Диагностика, выделение и определение возбудителя
В 1876 г. Роберт Кох выдвинул три постулата диагностики инфекционного заболевания:
1. Доказательство наличия возбудителя в больном организме;
Морфологическое доказательство с помощью светового или электронного микроскопа.
2. Выделение возбудителя и его размножение in vitro;
3. Искусственное возбуждение инфекционного заболевания в организме хозяина путем инокуляции возбудителем.
Эти требования легко выполнимы, если возбудитель может существовать in vitro и вызывать остро протекающее инфекционное заболевание, но в случае хронически протекающих, прерывающихся или латентных инфекций возникают большие трудности. Наконец, могут быть вторичные инфекции и смешанные заболевания, которые затрудняют диагноз. И все же возникновение инфекционного заболевания под действием определенного патогена можно гарантировать только в том случае, если постулаты Коха действительно выполнены.
Обычно выделение и размножение сапрофитных патогенов (т. е. большей части патогенных бактерий и грибов) легко удается при культивировании на искусственных средах (in vitro). Напротив, выделение и размножение, а также индукция заражения облигатных патогенов (вирусов, риккетсий и простейших) возможны или в определенном животном-хозяине (т. е. in vivo), или в пригодной для этой цели культуре клеток (in vitro).
Выделение патогенов требует диагностирования и определения систематического положения микроорганизма. Этой цели служат специальные дифференциально диагностические микробиологические или вирусологические методы. В качестве критериев в них используют морфологические, физические, химические и биологические (включая серологические) свойства возбудителей.
Получение вирусов и микроорганизмов
Обязательным условием массовой выработки патогенов является использование в качестве исходного материала для инокуляции определенных производственных штаммов. Для этого пригодна чистая культура из какой- либо коллекции штаммов или активный материал из банка возбудителей. В конце производственного процесса необходимо провести проверку идентичности исходного материала (инокулята) и конечного продукта.
Получение облигатных возбудителей инфекционных заболеваний
Получение в организме хозяина. Субстратом для выработки облигатных патогенов in vivo служит организм соответствующего хозяина. В зависимости от специфичности патогена для этого используют или только соответствующий вид (гомологичный хозяин), или заменяющий его вид (гетерологичный хозяин). К облигатным патогенам относятся наряду с определенными бактериями и грибами споровики (микроспоридии) и вирусы.
Способ получения микроспоридий можно рассмотреть на примере видов Nosetna из прямокрылых.
Суспензией спор Nosetna sp. опрыскивают корм (например, листья салата) и высаживают на него насекомого-хозяина (кобылок). N. locusiae — микроспоридия средней вирулентности, поэтому в полевых условиях гибель кобылок наступает только через достаточно длительный срок. Существуют родственные виды микроспоридий с более высокой вирулентностью, например N. acridiophagus и N. cuneatum, но зараженные ими насекомые в основном погибают еще до массовой спорулядии патогена в их организмах. Для решения проблемы производства микроспоридип вместо высоковосприимчивых видов прямокрылых можно использовать соответствующих гусениц чешуекрылых (особенно Heliothis zea); они пригодны в качестве промежуточных хозяев, так как при заражении вирулентными штаммами выживают в течение 2—3 недель. С целью выделения спор трупики насекомых-хозяев гомогенизируют и затем центрифугируют в градиенте плотности. Споры необходимо хранить в условиях, исключающих их спонтанное прорастание и инактивацию, например, хранение буферной суспензии в холодильнике (N. algerae), при глубоком замораживании (N. locustae) или, после сушки под вакуумом, — при низких температурах (N. pyraustae).
При производстве энтомопатогенных вирусов возникают в принципе те же проблемы, что и при производстве микроспоридий, но технология этого процесса более совершенна, и в некоторых случаях уже начата промышленная выработка вирусов.
Первым условием производства больших количеств каждого продукта in vivo является массовое разведение насекомых-хозяев или их личинок при пространственной изоляции выращиваемой расы от маточной, качество которой постоянно контролируется. В настоящее время для выращивания все чаще используют искусственную питательную среду, которая должна содержать наряду с основными питательными веществами (белки, углеводы) также стимуляторы роста (витамины, стерины) и минеральные соли. Поскольку разведение в условиях стерильности (аксенная культура) удается очень редко, в питательную среду обычно необходимо добавлять ингибиторы (консерванты, антибиотики или хемотерапевтические средства). Далее, культура нуждается в защите от нежелательных патогенов. С этой целью проводят соответствующие мероприятия, например дезинфекцию садков и яйцекладок формальдегидом и общий карантин инсектариев. Синхронно развивающихся насекомых или личинок, в соответствии с их поведением обитающих вместе или раздельно, содержат в оптимальных условиях (температура, влажность воздуха, фотопериод).
Для размножения вирусов in vivo обычно проводится непрямая инокуляция личинок путем загрязнения корма оптимальной дозой вируса в оптимальное время (фаза развития). Затем личинок инкубируют до накопления достаточного титра вируса, их трупы гомогенизируют и сырой продукт фракционируют градиентным центрифугированием. Фракцию вирусов (вирионов или белковых включений) консервируют в глицерине, хранят в виде буферного раствора при глубоком замораживании или лиофилизируют с добавлением защитных коллоидов; белковые включения можно также подвергать распылительной сушке.
Многие вирусы, патогенные для позвоночных, например возбудитель миксоматоза кроликов и родственные ему вирусы оспы, в настоящее время еще размножают в живых хозяевах, хотя по мере возможности этот способ заменяют легкодоступным размножением в куриных эмбрионах — промежуточном хозяине, при работе с которым легко соблюдать полную стерильность.
Для размножения вирусов используют обычно не сам куриный эмбрион, а только слои клеток его оболочки (мембрана хориоаллантоида); перед инокуляцией эмбрион удаляют, и таким образом яйцо служит чем-то вроде культуральной пробирки для вирусов. При обработке (очистка, концентрация в ультрацентрифуге) содержащей вирус жидкости, которая находится между эмбриональными оболочками, получают чистый вирус.
Получение в культуре клеток. Современная технология производства многих облигатных патогенов представляет собой размножение их в культуре клеток. Подобный способ in vitro все шире применяют при изготовлении вакцин для борьбы с вирусными патогенами позвоночных.
Для этого можно использовать так называемые первичные культуры, т. е. культуры, приготовленные непосредственно из клеток данного животного. Определенные органы животного-донора удаляют в асептических условиях, грубо измельчают и полученный гомогенат растворяют путем ферментативной обработки, получая суспензию отдельных клеток. Суспензию инкубируют в соответствующей среде до накопления достаточной биомассы. В определенных условиях альтернативой первичной культуре может служить вторичная культура, т. е. культура клеток, прошедшая многие пересевы.
После инокуляции культуры необходимым вирусом клетки продолжают размножаться до накопления патогена с достаточным титром. Затем вирусную фракцию отделяют, очищают и консервируют в определенных условиях.
Производство энтомопатогенных вирусов in vitro для борьбы с вредителями сельского хозяйства находится пока на первых этапах развития, но работы в этой области активно проводятся в различных странах, в том числе и в ФРГ.
Получение сапрофитных микроорганизмов
Питательные среды для массового производства сапрофитных бактерий и грибов должны содержать, помимо основных питательных веществ (аминокислот или пептидов, сахара или других углеводов), стимуляторы роста и минеральные соли (включая микроэлементы). При этом следует создавать оптимальные условия культивирования с учетом возможностей производства. В основном массовое размножение сапрофитов осуществляется двумя способами: поверхностная культура (т. е. на полужидкой среде в чашках Петри) и глубинная культура (в жидкой питательной среде, например в культуральных флаконах или ферментерах).
Поверхностная культура пригодна главным образом для получения конидий Fungi imperfecti, образующихся на воздушном мицелии (например, у Metarrhizium anisopliae). В качестве пищевого субстрата наиболее пригодно увлажненное стерилизованное жаром зерно хлебных злаков во флаконах, такой способ дает до 2·108 конидий/г зерна. При смывании водой с добавлением инертного смачивателя типа твина получают суспензию, из которой конидии отделяют центрифугированием. Обычный метод консервирования спор — лиофильная (но не распылительная) сушка.
Только те несовершенные грибы, которые в естественных условиях встречаются в водоемах (например, виды Culicinomyces), формируют в глубинной культуре настоящие конидии. Большая же часть. Fungi imperfecti при разведении этим методом образует дрожжеподобные бластоспоры, которые относительно плохо хранятся и поэтому менее пригодны для применения.
Виды Entomophthora (Е. thaxteriana, син. Е. obscura), пригодные для глубинной культуры, образуют в соответствующих питательных средах гифальные тела, из которых формируются покоящиеся споры. При выращивании этих видов в ферментере на среде с кукурузным экстрактом и маслом из кукурузных зародышей при 20°С за неделю получают 3·106 спор/мл. Перед прорастанием споры должны сначала пройти «яровизацию», что очень важно для их применения.
Бактерии получают как при поверхностном (на питательном агаре в чашках Петри), так и при глубинном (например, в питательном бульоне в колбах) культивировании. В условиях массового производства предпочтение отдают глубинному культивированию в ферментерах.
Вначале инокулюмом засевают посевной ферментер (емкость около 2 тыс. л), а его содержимым — соответствующий промышленный ферментер (емкость около 50 тыс. л). Состав дешевой промышленной питательной среды (%): меласса — 1,86; 50%-ный кукурузный экстракт — 3,4; хлопковое масло — 1,4; CaCO3 (в качестве буфера) — 0,1. На этой среде при 30—35 °С и хорошей аэрации получают 5·109 спор/мл. Биомассу из ферментированной среды отделяют путем центрифугирования с последующим лиофильным высушиванием (также для неспорообразующих форм) или путем распылительной, сушки (только для спорообразующих).
Качество и состав биопрепаратов
Контролирование качества биопрепаратов важно как для изготовителя, в том числе для официального допуска со стороны испытательных центров и органов здравоохранения, так и для потребителя. Оно гарантирует поступление в продажу эффективных и одновременно безопасных средств борьбы с вредителями. Контроль качества предусматривает следующее:
- идентичность и содержание действующего агента;
- чистоту препарата;
- эффективность против хозяина или целевого организма;
- безвредность для человека, животных и, при известных условиях, для других нецелевых организмов (например, пчел).
Доказательство идентичности специфического патогена, а также чистоты препарата, т. е. отсутствия загрязнителей и возбудителей болезней человека и животных, получают с помощью специальных микробиологических или вирусологических тестов.
Определение содержания активного агента в препарате служит для оценки эффективности производства и одновременно является основой для стандартизации конечного продукта. Его осуществляют различными методами, а именно: морфологически (подсчет числа клеток), культурально (определение числа жизнеспособных клеток в среде) или с помощью биотестов (определяя на соответствующих хозяевах ЛД50 и ИД50). Эффективность некоторых препаратов (например, В. thuringiensis) устанавливают по результатам биотеста, сопоставляя их с показателями препарата-стандарта.
Стандартизация, т. е. корректировка конечного продукта по желаемой активности (титр) путем добавления определенного нейтрального наполнителя, проводится в зависимости от формы препарата. При этой операции конечный продукт делают пригодным для целевого применения, вводя в него соответствующие добавки. Обычные формы биопрепаратов, применяемые в полевых условиях, — это суспензия, смачивающийся порошок, дуст, гранулят и приманка. Вплоть до внесения биопрепараты следует хранить в темноте и сухих прохладных условиях во избежание инактивации. Но и в оптимальных условиях биопрепараты устойчивы не беспредельно. Если полиэдренные вирусы в белковых оболочках и спорулирующие препараты Bacillus popilliae и Bacillus thuringiensis сохраняют активность в течение года, то жизнеспособность конидий Fungi imperfecti и микроспоридий довольно ограничена (период полураспада обычно меньше 6 месяцев). Еще короче (недели или дни) срок сохранения активности неспорообразующих бактерий, вирусов без включений и конидий энтомофторовых грибов.
Биотест готовых биопрепаратов на целевых организмах (например, насекомых-вредителях) проводится с целью предварительной оценки в лабораторных условиях и отработки дозы для полевых испытаний. Успешные полевые испытания завершают основную проверку биопрепаратов на эффективность в качестве средств борьбы.
Ориентировочные данные о возможном «побочном» действии патогена на нецелевые организмы устанавливаются еще до производства препарата при определении спектра активности. Дальнейшие показатели, получаемые в специальных опытах по определению безопасности, необходимы как основа для допуска к применению (оценка экономической и гигиенической безопасности).
К биопрепаратам, применяемым как средства борьбы, предъявляется следующее требование: кроме специфического для данного хозяина патогена, они не должны содержать никаких возбудителей болезней человека, животных, полезных насекомых или культурных растений. Это же относится к препаратам, предназначенным для инокуляции растений или почвы; естественно, что упаковка этих средств не стерильна.
Наиболее высокие требования предъявляются к качеству тех вакцинальных препаратов (вакцинам), которые вводят внутрибрюшинно человеку или животным. Они должны быть не только стерильными в отношении специфического возбудителя, но и не содержать никаких аллергенов. Вакцины для индивидуального использования выпускают в форме стерильных, готовых к употреблению водных (при необходимости — буферных и изотонических) коллоидных растворов. До использования их следует хранить в фирменной упаковке в холодильнике. Менее высокие требования предъявляются к вакцинам, используемым для введения per or (орально) человеку и животным, а также к биопрепаратам для преиммунизации растений, но и они не должны содержать никаких нежелательных агентов, кроме специфического возбудителя.
В живые вакцины вируса для защиты от бактериального загрязнения обычно добавляют антибиотик.
Стратегия применения
Применение микроорганизмов и вирусов для защиты от вредителей преследует различные цели: патогены используют или для профилактики, или непосредственно против имеющихся вредителей.
Профилактические методы
Стратегия профилактики осуществляется при борьбе с фитопатогенными грибами в почве с помощью антагонистов и при подавлении нематод соответствующими грибами (инокуляция почвы). Принципиально профилактическими являются также все так называемые активные защитные прививки подвергающихся опасности организмов от возбудителей инфекционных болезней. Подобные прививки, предназначенные для иммунизации, хорошо известны прежде всего в медицине и ветеринарии. При этом наряду с индивидуальными профилактическими прививками возможна и массовая профилактика: пероральная вакцинация контаминированной питьевой водой или продуктами питания. В практической фитопатологии профилактические прививки до сих пор имеют лишь небольшое значение.
Методы подавления
Методы подавления до сих пор были особенно успешными при борьбе с массовым размножением вредных макроорганизмов. В данном случае возможны две стратегии:
1. В район заражения вводят зараженную популяцию и ожидают ее распространения в популяции или биотопе хозяина: классическая концепция автодиссеминации, при которой добиваются замедленного действия. Для подобных искусственных эпидемий пригодны обычно только те патогены, которые могут длительно сохраняться в биотопе хозяина, причем либо в непрерывной инфекционной цепи, либо в каком-то резерваторе, к которым относятся также соответствующие переносчики болезней (векторы).
Примером индукции искусственной эпидемии служит акклиматизация возбудителя миксоматоза кроликов в Австралии и Европе, вироза индийского жука-носорога на островах Океании или Bacillus popilliae, длительно подавляющей личинок японского жука, в Северной Америке. Применение ржавчинных грибов в борьбе с сорной растительностью также подтверждает эту концепцию.
2. Патоген используется против хозяина как пестицид путем многократных поверхностных обработок: концепция биопестицида, при которой рассчитывают только на краткосрочное действие. Подобную стратегию применяют обычно в условиях, где соответствующий возбудитель болезни не способен длительно сохраняться в популяции или биотопе хозяина.
Типичным примером такого способа применения можно считать использование видов Colletotrichum в качестве «микогербицида» в борьбе с сорной растительностью. Однако многочисленные примеры использования энтомопатогенов, например Bacillus thuringiensis, вирусов ядерного полиэдроза и гранулеза, для борьбы с вредными гусеницами в сельском хозяйстве и лесоводстве также отвечают требованиям концепции биоинсектицидов. В связи с этим следует отметить, что, например, энтомопатогены после их нанесения на растения или на листовую поверхность могут относительно быстро инактивироваться под действием солнечных лучей, особенно ультрафиолетовой части спектра.
Достоинство использования возбудителей болезней в борьбе с вредителями заключается в узком круге их хозяев, что позволяет селективно поражать только определенные группы вредителей (так называемые целевые организмы) и щадить другие организмы (нецелевые), включая естественных врагов вредителей — антагонистов и энтомофагов. Поскольку патогены в основном совместимы с другими биотическими факторами смертности, последние можно использовать и дальше. Более того, микробиологические методы можно сочетать с другими способами подавления вредных насекомых, например с биотехническими приемами или с химическими обработками.
Необходимо, однако, указать и на потенциальный недостаток всех селективных методов, не считая того факта, что рынок их сбыта, естественно, невелик в сравнении с агентами (методами) широкого спектра действия: итогом успешного их применения может быть размножение видов вредителей, до сих пор подавлявшихся пестицидами широкого спектра действия, а при известных условиях невосприимчивые виды займут экологические ниши, освободившиеся при уничтожении близкородственного целевого вредителя. Относительно опасности развития устойчивости целевых организмов к патогенам нельзя сказать что-либо определенное, но по разным причинам (в том числе из-за вариабильности патогена) можно считать, что она должна быть слабее, чем при применении химических пестицидов.
Адаптация возбудителя и хозяина
Определимые естественные пределы эффективности инфекционного процесса зависят в основном от взаимного приспособления возбудителя и хозяина путем изменения вирулентности или толерантности, причем определенная роль также принадлежит иммунитету и интерференции.
Вирулентность и патогенность
Поразительные врожденные различия в вирулентности штаммов обнаружены у многих патогенов, в том числе у изолятов вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда разного географического происхождения и, соответственно, различной эпидемиологической основы. Изменчивость вирулентности — результат гетерогенности и отбора, причем для облигатных патогенов, например вирусов, хозяин как фактор отбора играет решающую роль. Хорошо известно ослабление вирулентности вируса миксоматоза кроликов, которое проявилось уже спустя несколько лет после его интродукции как в Австралию, так и в Англию. Для возбудителя преимущество ослабления вирулентности заключается в том, что он становится более приспособленным к «выживанию», так как патогены с пониженной вирулентностью легче устанавливают равновесные отношения со своими хозяевами (особенно, если хозяин одновременно обладает повышенной толерантностью). И наоборот, высоковирулентные штаммы патогена, поражая хозяина с повышенной восприимчивостью, могут погибнуть вместе с ним.
Однако последствием взаимодействия хозяина и возбудителя не всегда является снижение вирулентности. Она может усилиться, причем в том случае, когда возбудитель путем изменения вирулентности приспосабливается к ставшему толерантным хозяину. Возможно, что высоковирулентный лозаннский штамм вируса миксоматоза возник в результате подобной адаптации. Впрочем этот вирус, как и другие вирусы оспы, обладает выраженной антигенной стабильностью (противоположный пример — A-вирус гриппа).
Снижение вирулентности энтомопатогенных вирусов обычно наблюдали после определенного числа пассажей через культуру клеток. В то же время при многочисленных пересевах также удавалось выделять клоны с высокой пенетрантностью. Путем отбора ЛД50 вируса ядерного полиэдроза Heliothis zea была снижена на 80%, однако наиболее вирулентные изоляты остались неизменными.
Многие наблюдения указывают на потерю вирулентности и даже патогенности бактериями. Например, недавно было высказано предположение, что причиной снижения эффективности облигатного патогена Bacillus popilliae против личинок японского жука в полевых условиях является ослабление вирулентности, связанное с взаимной адаптацией хозяина и возбудителя.
У сапрофита В. thuringiensis при длительном разведении на питательной среде иногда появлялся минус- изолят по образованию кристаллического токсина и вследствие этого — потеря патогенности для гусениц. Особенно сильное снижение активности (по эндотоксину) отмечали при длительном выращивании на искусственной питательной среде бактерий, патогенных для млекопитающих, например Salmonella typhimurium.
Между тем снижение вирулентности не всегда нежелательно, оно необходимо в тех случаях, когда для профилактической прививки нужны ослабленные штаммы возбудителя. Примером может служить хотя бы полученный путем индуцированного мутагенеза ослабленный штамм вируса табачной мозаики М 11-16 для преиммунизации восприимчивых растений томатов.
Потенциальная опасность, которая характерна для живых вакцин с ослабленной вирулентностью, — это возможность мутационной реверсии вирулентности. Именно поэтому необходим постоянный контроль качества подобных вакцин.
Для разработки биопрепаратов с заданной степенью вирулентности, которая соответствует условиям использования, можно проводить в лабораторных условиях целенаправленный отбор. Если необходимый для этого гетерогенный штамм патогена отсутствует, то следует попытаться изолировать такие же дикие штаммы или изменить лабораторный штамм с помощью индуцированного мутагенеза.
Толерантность и устойчивость
Различия в восприимчивости молодых и старых животных хорошо известны, в связи с чем в вирусологии позвоночных в качестве подопытных животных преимущественно используют куриные эмбрионы и мышат (с еще не развитой иммунной системой).
У насекомых также наблюдают возрастное повышение толерантности к возбудителям болезней, причем оно зависит не только от изменения в неблагоприятную сторону соотношения между массой тела хозяина в процессе его роста и дозой патогена.
В качестве примера можно привести автохтонный вирус ядерного полиэдроза капустной совки Mamestra brassicae, ЛД50 которого составляет для гусениц 1-го возраста около 10 полиэдров, для 2-го — около 5·103 и 5-го возраста — около 5·107 полиэдров. В связи с этим говорят о возрастной толерантности. Кроме того, на определенных стадиях развития (яйцо, куколка, иногда имаго) насекомые невосприимчивы к таким возбудителям, как вирусы, бактерии и простейшие.
Существуют часто выраженные врожденные различия в типе реакции различных популяций на патогены, как, например, у Ephestia cautella на В. thuringiensis. Это же наблюдали у капустной белянки Pieris brassicae по отношению к соответствующему вирусу гранулеза и у моли Epiphyas postvittana — к вирусу ядерного полиэдроза. Правда, колебания в восприимчивости невелики: значения ЛД50 для различных популяций (гусеницы одного возраста), как правило, не превышают фактор 10.
Опасение, что при длительном использовании патогенов против вредителей у последних может развиться устойчивость, не лишено оснований. Такая ситуация могла сложиться, например, в популяциях японского жука Popillia japonica в восточных штатах США при использовании В. popilliae; в результате 35-летнего применения патогена в полевых условиях он мог потерять эффективность. В то же время использование в течение около 30 лет интродуцированного в Северную Америку вируса ядерного полиэдроза для подавления слизистого пилильщика до сих пор не привело к развитию устойчивости соответствующих популяций хозяина: вирусы продолжают регулировать численность вредителя. Соответствующие наблюдения сделаны при повторных внесениях В. thuringiensis против различных вредных видов бабочек, кроме того, они подтверждены и экспериментально. Лабораторные опыты с В. thuringiensis и капустной молью (10 или 30 поколений под давлением отбора 90%-ной или 60—80%-ной смертности) не показали сдвигов в устойчивости вредителя. Также безрезультатными оказались опыты по отбору на устойчивость к автохтонному вирусу ядерного полиэдроза в популяциях Heliothis zea (при давлении отбора 50—70%-ной смертности в течение 20—25 поколений).
Основой развития устойчивости является повышенное давление отбора со стороны возбудителя, которое зависит от плотности патогена и времени воздействия на хозяина. При прочих равных условиях устойчивость развивается скорее при постоянном давлении отбора вследствие длительного контакта между возбудителем и хозяином, чем при кратковременном контакте. Это, однако, означает, что классическая концепция биологической борьбы при интродукции возбудителя в биотоп вредителя находится под большей угрозой развития устойчивости, чем альтернативная концепция биопестицидов, пока последняя не изменится в результате длительного их применения. В этом смысле эндемическую ситуацию во многих природных системах возбудитель — хозяин следует рассматривать как сосуществование на основе взаимной адаптации относительно патогенности (вирулентности) и устойчивости (толерантности).
Помимо давления отбора, наличие генов устойчивости в генофонде популяции хозяина также является одной из решающих предпосылок для возможного развития устойчивости. Наоборот, при высокой гетерогенности этот процесс может ослабнуть при условии снижения давления отбора. Далее, для скорости, с которой изменяется устойчивость, имеет значение число поколений хозяина.
Так, при соответствующих предпосылках у быстро размножающихся микроорганизмов устойчивость развивается гораздо быстрее, чем у медленно размножающихся микроорганизмов.
В популяциях относительно быстро размножающихся грызунов, в частности у диких кроликов Oryctolagus cuniculus, выявлено развитие устойчивости к вирусу миксоматоза: в 1970 г. в Англии была зарегистрирована 60%-ная гибель кроликов от миксоматоза, а в 1976 г. в полевых условиях — только 20%-ная. В то же время патоген, выделенный из диких кроликов, вызывал постоянную гибель 70—95% лабораторных животных.
Проявление устойчивости и при известных условиях перенос факторов устойчивости на антагонистов часто ограничивают возможности биологической борьбы с бактериями. Недавно в связи с разработкой профилактических мер борьбы с бактериальным раком корней было обнаружено, что при контакте вирулентных восприимчивых штаммов Agrobacterium radiobacter var. tumefaciens с бактериоциногенными (изолят 84) появляются новые формы, толерантные к бактериоцину. Очевидно, это рекомбинанты, которые содержат как гены вирулентности, так и гены, обусловливающие способность продуцировать бактериоцин. Значение их для практики пока еще спорно.
Существующая возможность отбора соответствующих патогенов по вирулентности с помощью устойчивых популяций хозяина означает, однако, что последствия возникновения устойчивости к биопрепаратам в конце концов не имеют такого значения, как ее формирование к химическим пестицидам.
Возникновение устойчивости к патогенам не всегда нежелательно. Это явление используется, например, в селекции на устойчивость культурных растений к болезням и наряду с мероприятиями по фитосанитарии представляет не менее важный биологический способ защиты.
Интерференция и иммунитет
Если результаты заражения хозяина одним возбудителем еще относительно легко учесть, используя кривую доза : смертность, то при одновременных или последовательных множественных инфекциях это гораздо сложнее. Трудность заключается во взаимодействиях микроорганизмов — синергизме или антагонизме.
Типичная форма синергизма — это гиперинфекция, которая почти регулярно возникает у беспозвоночных при последовательном заражении одним и тем же вирусом. У позвоночных в сравнимых условиях, как правило, можно ожидать подавления вторичной инфекции в результате благоприобретенного иммунитета.
Однако у беспозвоночных и даже у растений в определенных условиях иногда проявляется тормозящий эффект первичной инфекции в отношении ко вторичной, особенно при вирозах. В этом случае говорят об интерференции. Вирусспецифическая интерференция, которая носит также название перекрестной защиты, широко распространена. Это явление используют при преиммунизации для борьбы с вирусными болезнями культурных растений. На интерференции базируется также толерантность латентно инфицированных (лизогенных) популяций бактерий к фагам, которые родственны типичным для данной популяции бактериофагам. Подобный «иммунитет» до последнего времени часто маскировался успешной фаговой терапией инфекционных заболеваний.
Особая форма неспецифической вирусной интерференции, которая возникает, очевидно, только у позвоночных, основана на образовании биологически активного вещества, так называемого интерферона, который индуцируется вирусом при первичном заражении и защищает клетки пораженного хозяина от нового заражения тем же или другим вирусом. Только для позвоночных характерен также благоприобретенный иммунитет, основанный на выработке так называемых антител. Антитела образуются в результате первичной инфекции и специфически нейтрализуют данного или близкородственного возбудителя при вторичной инфекции. Эти явления могут быть использованы при активной иммунизации и, следовательно, в борьбе с возбудителями болезней человека и животных.
Таким образом, путем инокуляции хозяина штаммами возбудителя с ослабленной вирулентностью можно ограничить его восприимчивость к вирулентным диким штаммам, не изменяя плотности популяции. Кроме того, преиммунизация и иммунизация обусловливают экологическое вытеснение вирулентных диких штаммов безвредными защитными штаммами.