Методы оценки устойчивости древесных пород к возбудителям болезней

 

Методы оценки устойчивости древесных пород к патогенам основаны на теоретических концепциях фитоиммунитета.

Прежде всего следует исходить из генетики иммунитета. Устойчивость древесных растений связана с их биологическими особенностями и носит полигенный характер. Эта устойчивость существует как результат анатомических особенностей каждого вида, формы и сорта древесной породы и зависит, кроме того, от комплекса абиотических факторов, сочетание которых специфично для каждого экологического региона. Поэтому при выборе устойчивых форм растений необходимо ориентироваться в первую очередь на специфику местных условий, определяющих агрессивность патогена.

При оценке видов и форм древесных растений следует ориентироваться на комплексную (горизонтальную) устойчивость, которая может быть охарактеризована с помощью полевых учетов, а также на повышенном инфекционном фоне или в экстремальных условиях внешней среды.

При оценке доноров устойчивости, которые предполагается использовать в процессе селекции, необходимо использовать также и расоспецифические реакции, которые могут быть получены в результате искусственного заражения изучаемых форм отдельными расами или биотипами патогенов (вертикальная устойчивость).

В силу особенностей патогенеза методы оценки устойчивости растений к облигатным паразитам, факультативным сапротрофам и факультативным паразитам будут различными.

Рассмотрим эти методы подробнее.

С помощью полевых методов оценки устойчивости древесных пород определяется их полигенная (горизонтальная) устойчивость применительно к данному региону и конкретным экологическим условиям. Поскольку условия, благоприятствующие развитию болезни, проявляются не каждый год, полевые наблюдения должны проводиться в течение нескольких лет (не менее трех) с характеристикой средних и максимальных данных о проявлении заболевания. Это осуществляется с помощью специальных балловых шкал, характерных для каждого заболевания. При полевых учетах рекомендуется использовать следующую пятибалльную шкалу:

0 — растение здоровое;

1 — слабое поражение;

2 — среднее развитие болезни;

3 — среднее развитие болезни, отдельные части растения поражены в сильной степени;

4 — сильное развитие болезни;

5 — погибшее растение.

При проведении полевых учетов определяются распространенность болезни и интенсивность поражения растений или развития болезни.

Распространенность, или процент, больных растений устанавливается по формуле

P = (n∙100) : N,

где Р — распространенность болезни (%), N — общее количество учтенных растений, n — количество больных растений.

Для определения развития болезни применяется следующая формула:

R = ∑(ab) : n,

где R — развитие болезни (балл), ∑ab — сумма произведений числа растений на соответствующий балл поражения, n — общее количество больных растений.

Для характеристики вида или формы древесной породы за несколько лет в определенной зоне указываются средний и максимальный балл развития болезни. Оценка устойчивости осуществляется по максимальному баллу со следующими градациями: 0 — иммунные; 0,1-1,4 — практически устойчивые; 1,5-2,5 — слабопоражаемые; 2,6-3,4 — среднепоражаемые; более 3,5 — сильнопоражаемые. При выборе устойчивых форм следует иметь в виду, что устойчивые генотипы формируются прежде всего на совместной родине хозяина и паразита. Это положение особенно важно при выявлении устойчивых форм среди интродуцентов или в случае появления нового заболевания.

Большое значение при полевой оценке имеют экологические факторы.

Погодные условия оказывают влияние на частоту эпифитотий и агрессивность патогенов, и поэтому понятие полевой устойчивости применительно к многолетним растениям носит географический характер.

Метод полевой оценки устойчивости растений хотя и дает хорошие результаты, однако занимает длительный промежуток времени. Поэтому рекомендуется использовать различные методы искусственного заражения. Здесь следует иметь в виду, что в зависимости от района могут изменяться и паразитические свойства патогенов, что связано с географической изменчивостью их популяций.

Поэтому при фитопатологической оценке необходимо стремиться к тому, чтобы инфекционный материал по своему качественному составу соответствовал разнообразию популяции данного агроклиматического района. В качестве инокулюма лучше использовать инфекционный материал, взятый непосредственно из природы.

Для испытания растений на повышенном инфекционном фоне в качестве дополнительных источников заразного начала возможно использование пораженных растительных остатков, собранных в лесу или в питомнике. При изучении устойчивости древесных пород к почвенным патогенам инокулюм предварительно размножают в чистых культурах на питательной среде, с которой он затем вносится в почву.

Обычно в качестве питательного субстрата для этих целей используются зерна злаков, которые заливаются водой в колбах (в соотношении 1:1) и стерилизуются в автоклаве при давлении в 1 атм. Затем колбы с зерном заражаются и выдерживаются 10-15 сут. с периодическим встряхиванием. Семена голозерных культур (пшеница, рожь, просо, зернобобовые) смешиваются с мякиной или мелконарезанной соломой. Нормы внесения инфекционного материала для каждого патогена и породы различные. Можно рекомендовать следующие: 3 кг культуры на 100 кв. м питомника или 1,5-2 кг на питающую площадь одного дерева.

При селекционной работе возникает необходимость изучать отношение той или иной формы растения к определенным штаммам патогена, различающимся по вирулентности. Для этого проводится исследование состава популяции фитопатогенных грибов. С каждого вида растения гриб рассеивают на 100 чашках Петри с агаровой средой. У каждого штамма определяют процентный состав колоний, различающихся по культуральным признакам, которые отсевают на косой агар. Для более тщательного анализа и выделения генотипически однородных линий применяют метод моноспоровой культуры. Генетически однородный материал получают после трехкратного моноспорового последовательного пересева.

При исследовании состава популяции облигатных паразитов, которые на обычных средах не произрастают, используют определенные наборы так называемых сортов-дифференциаторов. Эти сорта заражают спорами грибов и учитывают характер их поражения, затем по специальным шкалам определяют расу или биотип патогена.

При искусственном заражении растений грибами в полевых условиях надземные органы предварительно изолируются с помощью полиэтиленовой пленки, остекленных каркасов и других приспособлений по крайней мере на 1-2 инкубационных периода, чтобы убедиться в их здоровом состоянии. Возможно также проведение опытов в лабораторных условиях на срезанных частях растений, помещенных в воду, питательный раствор, или на отдельных листьях, помещенных в раствор бензимидазола. Приемы инокуляции растений довольно разнообразны и зависят от биологии гриба, патогенеза заболевания и задач исследования. В зависимости от поставленной задачи используют различные инокулюмы: мицелий, споры с одного вида растения или географического района и т. д.

При изучении устойчивости древесных пород к парше (возбудители — грибы р. Venturia) на деревьях отбирают ветки с листьями в фазе начала распускания, которые изолируют полиэтиленовыми мешочками на 7 дней для выявления естественного заражения паршой. Изолированные ветки, не имеющие листьев с признаками парши, срезают и помещают в колбы с раствором полной питательной среды, после чего сразу проводят их искусственное заражение споровой суспензией гриба. Затем колбы с ветками помещают во влажные камеры на 24 ч при температуре +19…+22°С. Для приготовления влажных камер применяются стеклянные колпаки, которые изнутри выстилаются увлажненной фильтровальной бумагой. По истечении указанного срока влажные камеры снимают, растения оставляют в оранжерее при той же температуре и относительной влажности воздуха не ниже 75%. В этих условиях первые признаки парши можно обнаружить на восприимчивых растениях через 6-8 дней.

При изучении внутривидовой изменчивости возбудителя парши и описания их морфокультуральных признаков гриб необходимо выделить в чистую культуру. Лучшими средами для выращивания возбудителей парши древесных пород служат дрожжевой (100 г дрожжей, 10 г сахара, 20 г агар-агара, 1 л воды) и картофельно-глюкозный (200 г очищенного картофеля, 100 г глюкозы, 20 г агар-агара, 1 л воды) агары. На этих средах при оптимальных условиях (+19…+22°С) рост гриба начинается на 3-й, а спороношение — на 5-й день после посева гриба на питательную среду. При оценке устойчивости селекционного материала рекомендуется использовать смесь изолятов с различных по устойчивости форм данного вида растения, собранных в различных экологических зонах.

Определение устойчивости растений к мучнистой росе осуществляется по средствам инокуляции сухими конидиями органов растений.

Ускоренную оценку можно проводить заражением отдельных одновозрастных молодых листьев с черешками. Черешки листьев срезанными концами помещают во влажный тампон, периодически смачиваемый водой, питательным раствором Кнопа или раствором бензимидазола. Листья инокулируют суспензией конидий и помещают в чашки Петри. Прорастание конидий на месте при оптимальных условиях происходит уже через 6 ч, а через 72 ч начинает формироваться конидиальное спороношение.

Результаты инокуляции отдельных листьев учитывают через 3, 5, 10 дней, отмечая число положительных инокуляций и интенсивность развития налета на листовой пластинке.

При оценке устойчивости древесных растений к факультативным паразитам опыты проводят на фоне постепенного ослабления растения или отдельных его органов. Схему таких работ в лабораторных условиях мы предлагаем следующую.

С каждого испытываемого вида или формы растения одного возраста срезаются одревесневшие побеги длиной 150 мм и толщиной около 10 мм в количестве 20 шт. Затем на расстоянии 50 мм от вершины делается вырез глубиной до 5 мм и после поверхностной стерилизации в него помещается кусочек агаровой среды с мицелием гриба. Место инокуляции обтягивается полоской полиэтиленовой пленки, которая закрепляется по краям.

Черенки ставят в стаканчики с водой, и за ними ведется систематическое наблюдение. Находясь в воде, черенки начинают испытывать недостаток минеральных веществ, их жизненные функции ослабевают, и они гибнут. Этот процесс происходит в течение длительного времени, что позволяет определить сроки осуществления инфекции черенков различной степени ослабления, а следовательно, и болезнетворную способность грибов, и устойчивость к ним растений. При этом состояние зараженных побегов сравнивается с контрольными. Всего делается 10 контрольных и 10 опытных определений. Интенсивность развития болезни определяется по скорости развития возбудителя. Регистрация результатов опыта проводится в момент гибели 2/3 черенков самого восприимчивого вида или восприимчивой формы. В случае если по краям ранки наблюдается усиленный рост каллюса, ранку следует подчистить и провести вторичную инокуляцию, не прерывая опыта. Оценка существенности различий делается с помощью статистических методов. Если разница между зараженными побегами изучаемых видов и форм не доказывается, их следует отнести по устойчивости к патогену в одну группу. Отсутствие различия в скорости гибели черенков в контрольных и опытных вариантах может указывать и на сапрофитную природу изучаемого гриба.

С целью сравнительной оценки устойчивости растений к факультативным паразитам использовали специальный показатель — «порог устойчивости», который выражается в относительных величинах и рассчитывается по формуле

П = В : А,

где П — порог устойчивости, А — промежуток времени, в течение которого погибают контрольные растения (сут.), В — промежуток времени, в течение которого погибают зараженные растения (сут.). В том случае, когда растения иммунны к данному патогену (В = А), порог устойчивости равен 1.

При изучении устойчивости древесных пород к возбудителям трахеомикозного усыхания, обладающим высокой патогенностью, инокуляцию можно проводить в полевых условиях по той же схеме, применяя в качестве инокулюма суспензию спор.

Для проведения исследований по устойчивости сортов и выявлению патогенных штаммов изучаемые грибы выделяются в чистую культуру. В качестве питательной среды рекомендуется применять агаризированную водную вытяжку из веток исследуемой породы, которая приготовляется следующим образом. В колбу, заполненную мелко нарезанными побегами, добавляют водопроводную воду. Сосуд помещают на сутки в термостат при температуре +80°С, после чего отвар охлаждают, жидкость отфильтровывают и добавляют 0,5% агар-агара. Среду стерилизуют 2 ч текучим паром и разливают в чашки Петри. Инокуляцию среды производят каплей экссудатов спор, взятых из одной пикниды или ложа. Хранить выделенные штаммы рекомендуется в пробирке на стерильных отрезках коры или ветвей.

Новый этап в фитоиммунологии начался с развитием методов молекулярной генетики. С 80-х годов прошлого века по мере повышения общего уровня науки к традиционным направлениям работы прибавились исследования в области молекулярной биологии, генетической инженерии, биотехнологии, что безусловно внесло поток нового генетического материала в селекцию. В настоящее время в ведущих лабораториях мира активно ведутся работы по клонированию генов устойчивости, изучению их структуры и функций.

Используя методы генетической инженерии, можно целенаправленно вводить нужные гены в геном культурных растений. В настоящее время осуществляются массовые работы по поиску молекулярных маркеров и клонированию генов устойчивости. Идея модификации растений с целью повышения их устойчивости к вредным организмам реализуется путем создания трансгенных растений.

Использование методов культуры тканей и генно-инженерных технологий позволяет значительно сократить время получения устойчивых к болезням, вредителям или неблагоприятным воздействиям клонов древесных растений. За последние годы сразу несколько селекционных центров передали на размножение в питомники резистентные к «голландской болезни» клоны вяза, которые уже начали использовать в озеленении.